酶活分光光度試劑盒通過連續(xù)記錄光吸收的增加速率來計算酶促反應(yīng)速度。使用HITACHI日立分光光度計或酶標(biāo)儀實時監(jiān)測這一過程，獲得準(zhǔn)確的反應(yīng)曲線數(shù)據(jù)。分光光度法的核心基于朗伯-比爾定律，即溶液中物質(zhì)對特定波長光的吸收程度與其濃度成正比。當(dāng)單色光通過均勻有色溶液時，部分光線被吸收，未被吸收的光強(qiáng)變化可反映溶質(zhì)濃度。
 

　　顯色反應(yīng)與產(chǎn)物定量：例如，LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸后，后者進(jìn)一步與2,4-*肼作用形成棕紅色化合物，該化合物在堿性條件下的顏色深淺直接對應(yīng)丙酮酸含量，從而間接反映酶活性；另一種方法是DNS比色法，如植物蔗糖酶分解蔗糖產(chǎn)生的還原糖與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)生成棕紅色產(chǎn)物，其在540nm處的吸光值可用于量化酶活。

 

　　酶活分光光度試劑盒的測定步驟：
 

　　1.準(zhǔn)備工作
 

　　-檢查試劑與器材：確認(rèn)試劑盒內(nèi)包含所有試劑和說明書，并核實其保存條件及有效期限；同時準(zhǔn)備好離心機(jī)、吸管、移液器等實驗所需儀器和耗材。
 

　　-樣本準(zhǔn)備：根據(jù)實驗設(shè)計獲取待測樣本，確保樣本數(shù)量和質(zhì)量符合要求。若樣品濃度過高，需提前進(jìn)行預(yù)測并適當(dāng)稀釋至試劑盒檢測范圍內(nèi)，計算時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
 

　　2.加樣操作
 

　　-設(shè)置對照與樣本孔：分別設(shè)立空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔。空白孔加入樣品稀釋液(如100μl)，其余孔依次加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品(同樣為100μl)。注意避免產(chǎn)生氣泡，將液體加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁。
 

　　-混勻處理：在試劑或樣品稀釋時充分混勻，但應(yīng)盡量避免起泡，以保證反應(yīng)體系的均勻性。
 

　　3.反應(yīng)與測定
 

　　-啟動反應(yīng)：按照說明書指示添加特定底物或輔酶等啟動劑，引發(fā)酶促反應(yīng)。不同試劑盒可能涉及不同的生化反應(yīng)機(jī)制(如NAD+/NADH互變、顯色產(chǎn)物生成等)。
 

　　-分光光度檢測：使用HITACHI日立分光光度計在預(yù)設(shè)波長下讀取各孔的吸光度值。例如，某些試劑盒通過監(jiān)測還原型輔酶Ⅰ的變化來量化酶活性。
 

　　4.數(shù)據(jù)分析
 

　　-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中的酶活性單位，結(jié)合稀釋倍數(shù)得出結(jié)果。